Sejak awal mula pandemik ini, berbagai usaha telah dilakukan untuk mengembangkan strategi diagnosis yang efektif dalam mengidentifikasi penderita COVID-19. Pemeriksaan diagnosis yang efisien memegang peran penting dalam mengidentifikasi pasien pada tahap awal infeksi sehingga mampu menurunkan risiko penularan dan konsekuensi lainnya.[1,2]

Saat ini, telah tersedia berbagai metode pemeriksaan diagnosis yang telah disetujui badan otoritas di seluruh dunia. Misalnya di Eropa, terdapat 365 metode pemeriksaan COVID-19 komersial yang telah disetujui oleh Food and Drug Administration (FDA), yang terdiri dari 192 pemeriksaan berbasis polymerase chain reaction (PCR), 168 pemeriksaan immunoassay, 3 pemeriksaan berbasis Next Generation Sequencing (NGS), dan 2 pemeriksaan teknologi lainnya.[2.3]

Namun, ketersediaan berbagai metode pemeriksaan ini menimbulkan kebingungan di kalangan praktisi kesehatan dalam menentukan pemeriksaan yang terbaik untuk pasiennya. Metode pemeriksaan diagnosis yang akurat, cepat, mudah digunakan, relatif murah, sederhana, dan bersifat point of care masih tetap diunggulkan dalam strategi diagnosis COVID-19.[2]

Disamping strategi pemeriksaan baku emas dengan menggunakan RT-PCR, terdapat beberapa metode pemeriksaan diagnostik terbaru yang mulai banyak digunakan, antara lain PCR digital, teknik isothermal amplification (IA), cluster of regularly interspaced short palindromic repeats/Cas (CRISPR/Cas), biosensor, metode berbasis mikroskopis-elektron dll.[2]

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Metode RT-PCR menjadi pemeriksaan baku emas konfirmasi diagnosis COVID-19 secara luas karena dapat memberikan hasil yang akurat, dan telah banyak tersedia di rumah sakit maupun laboratorium mandiri. Pada umumnya, pemeriksaan RT-PCR memiliki sensitivitas 77‒81% dan spesifisitas 100% dalam mendiagnosis COVID-19. Hal ini dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain waktu pengambilan sampel, jenis sampel, dan kemampuan deteksi alat.[2,4]

Secara singkat, prosedur pemeriksaan RT-PCR mencakup tahapan berikut ini:

• Mengekstraksi RNA virus pada sampel dengan menggunakan kit komersial dan cairan lisis secara manual maupun otomatis
• Mengubah RNA yang didapat kemudian diubah menjadi complementary DNA (cDNA) melalui proses reverse transcription

• Mengamplifikasi target virus secara eksponensial menggunakan probe yang spesifik
• Mendeteksi sinyal fluoresens secara real-time oleh alat dan berbanding lurus dengan jumlah target virus yang teramplifikasi pada sampel[2,5,6]

Seluruh tahapan tersebut membutuhkan waktu ±4‒8 jam bergantung pada tipe dan prosedur RT-PCR yang digunakan. Prosedur RT-PCR yang dilakukan secara manual membutuhkan waktu hingga 24 jam. Metode RT-PCR hingga saat ini masih digunakan untuk strategi surveilans luas, karena biaya yang relatif murah dan mampu mengekstraksi virus secara keseluruhan.[2,5]

Kelebihan RT-PCR

Beberapa kelebihan pemeriksaan RT-PCR adalah waktu pemeriksaan yang relatif cepat, teknik eksekusi pemeriksaan yang mudah, reprodusibilitas yang baik, standarisasi data tanpa dipengaruhi bias operator, dan kontrol kualitas terstandarisasi. Selain itu, RT-PCR mampu mendeteksi RNA SARS-CoV-2 yang rendah, yaitu  dengan limit of detection (LOD) ~5‒50 copies cDNA virus pada setiap reaksi.[2,7,8]

Keterbatasan RT-PCR

Pemeriksaan RT-PCR memiliki keterbatasan yang dapat berujung pada hasil negatif palsu maupun positif palsu. Salah satu keterbatasan RT-PCR adalah sensitivitas yang rendah pada sampel individu yang asimptomatik dan pauci simtomatik dengan viral load yang sedikit. Selain itu, akurasi pemeriksaan RT-PCR juga sangat dipengaruhi oleh faktor pra-analitik dan analitik.[2,7,8]

Faktor pra-analitik meliputi  teknik pengambilan swab, penyimpanan sampel, dan transportasi sampel. Sedangkan faktor analitik meliputi risiko kontaminasi pada saat pengerjaan, kontrol kualitas alat, dan bias pembacaan grafik oleh operator. Perhatian khusus dan kewaspadaan yang tinggi sangat diperlukan pada pemeriksaan RT-PCR. Selain itu, RT-PCR juga membutuhkan alat thermocycler yang mampu mengatur suhu pada berbagai tahapan PCR, yaitu 92-95^oC pada tahap denaturasi, 52-60^oC pada tahap annealing, dan 70-75^oC pada tahap extension.[2,7,8]

Isothermal Amplification

Pemeriksaan asam nukleat berbasis IA telah banyak dikembangkan untuk mendeteksi SARS-CoV-2, dengan sensitivitas yang serupa dengan RT-PCR. Pada prosedur pemeriksaannya, metode IA menggunakan satu temperatur dan tidak memerlukan peralatan laboratorium yang canggih. Metode pemeriksaan IA yang telah banyak digunakan antara lain amplifikasi rekombinase polimerase, amplifikasi helicase-dependent, dan loop-mediated isothermal amplification (LAMP).[2,5,6]

Berbagai negara telah menyetujui penggunaan metode LAMP untuk mendeteksi SARS-CoV-2 dengan menggunakan enzim DNA polimerase dan 4-6 primer yang mengikat regio spesifik pada target gen. Pemeriksaan LAMP dipercaya sangat spesifik, bahkan melebihi PCR konvensional, karena menggunakan banyak primer pada reaksinya. Berbagai alat dengan metode LAMP menunjukkan nilai sensitivitas hingga 100% untuk deteksi gen ORF1ab.[2,5,6]

Prosedur pemeriksaan LAMP terdiri dari:

• Menuang sampel pasien yang diambil dari swab nasal/naso-orofaring ke dalam tabung/kartrid yang telah disediakan oleh alat
• Memproses amplifikasi DNA pada alat secara otomatis
• Mendeteksi sinyal amplifikasi alat berdasarkan turbiditas, warna, atau fluoresens reaksi[5,6]

Proses analisis akan berlangsung selama <1 jam pada suhu 60‒65 ^oC dengan batas terendah LOD virus adalah ~75 copies pada setiap reaksi.[5,6]

Kelebihan LAMP

Kelebihan LAMP adalah pengerjaannya yang sederhana, kemudahan visualisasi pembacaan/deteksi, sinyal background noise yang rendah, risiko transmisi dan kontaminasi yang rendah, dan tidak membutuhkan alat thermocycler.[5-8]

Keterbatasan LAMP

Salah satu keterbatasan LAMP yaitu sulit mendeteksi sampel dengan jumlah virus yang sedikit sehingga memberikan hasil negatif palsu. Beberapa kekurangan lain pemeriksaan LAMP antara lain sulitnya optimasi primer spesifik alat, kompleksitas reaksi, keterbatasan kontrol kualitas internal, dan keterbatasan untuk menduplikasi reaksi apabila diperlukan.[5-8]

Aplikasi Klinis RT-PCR Vs LAMP

Pemeriksaan RT-PCR memiliki sensitivitas yang signifikan sebagai pemeriksaan deteksi SARS-CoV-2 utama. Pertimbangan penggunaan RT-PCR terutama pada kondisi yang menuntut hasil yang akurat dengan beban sampel yang banyak. Pemeriksaan RT-PCR belum dapat menjadi pilihan utama diagnostik di fasilitas pelayanan kesehatan primer, terutama di pelosok daerah.[6]

Hal ini dikarenakan RT-PCR membutuhkan peralatan yang mahal, tenaga laboratorium yang terlatih, pengiriman sampel, biaya, dan prosedur pemeriksaan yang relatif lama. Sebaliknya, LAMP merupakan metode amplifikasi asam nukleat yang sensitif dan mampu mendeteksi SARS-CoV-2 dalam waktu ±1 jam. LAMP merupakan pemeriksaan yang sederhana, cepat, cost-effective, dan bersifat point of care.[6,10]

Strategi diagnostik dengan LAMP dapat dilakukan bila tujuan pemeriksaan tidak membutuhkan kuantifikasi infeksi yang terjadi, dan hanya membutuhkan hasil kualitatif (positif atau negatif) untuk konfirmasi. Pemeriksaan LAMP dapat dilakukan sebelum merujuk sampel untuk pemeriksaan RT-PCR skala besar, dimana hal ini sangat bermanfaat dalam kondisi pandemik saat ini.[6,10]

Tabel 1. Perbandingan Pemeriksaan RT-PCR dan LAMP dalam Mendeteksi SARS-CoV-2

RT-PCR	LAMP
Alat besar dan rumit	Alat kecil, sederhana, portable, dan point of care sehingga dapat digunakan sebagai pemeriksaan di rumah
Membutuhkan thermal cycler khusus	Membutuhkan heat block, atau hot plate
4-8 jam hingga keluar hasil	1 jam hingga keluar hasil
Membutuhkan tenaga laboratorium khusus terlatih	Tidak membutuhkan tenaga laboratorium khusus
Membutuhkan tahapan reverse transcription	Analisis langsung terhadap RNA virus
Reaksi dapat tidak stabil akibat faktor pengganggu pada sampel, membutuhkan tahapan purifikasi	Mampu mentoleransi faktor pengganggu dan bersifat stabil
Mendeteksi DNA	Mendeteksi DNA dan RNA

Sumber: dr.Petty A,SpPK. 2021.[12]

Penelitian oleh Inaba et al. membandingkan metode LAMP dan RT-PCR berdasarkan onset penyakit. Hasil penelitian mendapatkan akurasi pemeriksaan LAMP 100% apabila dikerjakan hingga hari ke-9 sejak onset gejala, yaitu sama dengan RT-PCR pada infeksi COVID-19 fase akut.[4,11,12]

Metode LAMP juga menunjukkan sensitivitas 56,6% dan spesifisitas 98,4% apabila dibandingkan dengan RT-PCR, sedangkan RT-PCR memiliki sensitivitas 77‒81% dan spesifisitas 100% dalam mendiagnosis COVID-19. Positivity rates pemeriksaan RT-PCR adalah  50%, sedangkan LAMP adalah 29%.[4,11,12]

Kesimpulan

Pemeriksaan isothermal amplification (IA) yang sering digunakan saat ini adalah metode loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Metode ini dapat menjadi pilihan strategi diagnostik pada kasus COVID-19, terutama pada fase akut. Pemeriksaan LAMP dapat dikerjakan secara sederhana oleh individu tanpa pelatihan khusus, sedangkan RT-PCR membutuhkan fasilitas alat yang mahal dan tenaga ahli dengan keterampilan khusus.

Pemeriksaan LAMP juga dapat  memberikan hasil yang lebih cepat, akurasi serupa dengan RT-PCR, dan relatif murah. Oleh karena itu, sangat bermanfaat sebagai salah satu strategi diagnostik surveilans di Indonesia, karena mampu dikerjakan secara sederhana di seluruh pelosok daerah, dan memberikan hasil yang cepat dan akurat. Hal ini penting dalam upaya penanganan transmisi COVID-19 lebih lanjut.

Untuk meningkatkan sensitivitas LAMP pada kasus dengan kecurigaan jumlah virus yang rendah, maka dapat dilakukan penambahan pemeriksaan konfirmasi selanjutnya dengan metode RT-PCR.